Proteinaufarbeitung
Aus Zellkulturen:
Lösungen:
4x Laemmli Probenpuffer
Procedere:
Zellen in 75cm2 Zellkulturflaschen bis zur Konfluenz kultivieren
Medium absaugen
Zellmonolayer zweimal kurz mit PBS spülen
6 ml 4x Laemmli Probenpuffer aufgeben und 10 Min. bei Raumtemperatur einwirken lassen
Probenpuffer mit der Pipette auf und abpipettieren bis alle Zellen sich aufgelöst haben
In 15 ml Falcon Röhrchen überführen und bei -80°C einfrieren.
Aus Gewebstücken:
Lösungen und Geräte:
Mörser und Pistill auf -20°C vorkühlen
4x Laemmli Probenpuffer
Flüssiger Stickstoff
Procedere:
Gewebe in flüssigem Stickstoff einfrieren und im gefrorenen Zustand unter Zugabe von flüssigem Stickstoff im Mörser zerkleinern
6 ml 4x Laemmli Probenpuffer zugeben und unter weiterer Betätigung des Mörsers auftauen lassen
Proteinlösung in Dounce Homogenisator überführen und durch auf und abziehen des Pistills Gewebe komplett homogenisieren.
Proteinlösung in Falcon Röhrchen übertragen und bei -80°C einfrieren.
Tüpfeltest zur Proteinkonzentrationsbestimmung
Materialien:
Laemmli Puffer 4x
Bovines Serumalbumin Fraktion V
Amidoschwarz
Methanol
Essigsäure rauchend
Nitrozellulosemembran
Kopierfolien
Lösungen:
Proteinstandards:
Färbelösung:
0,1% Amidoschwarz (40mg)
45% Methanol (18ml)
10% Essigsäure rauchend (4ml)
mit H2Odeion auf 40ml auffüllen
Entfärber:
90% Methanol (90ml)
2% Essigsäure (2ml)
mit H2Odeion auf 100ml auffüllen
Procedere:
Membran in eine Bakterienschale legen
Von jeder Probe der Standardreihe ein Volumen von 4µl doppelt auf die vorbereitete Nitrozellulosemembran auftropfen
Anschließend von jeder der zu untersuchenden Proben ein Volumen von 4µl doppelt auf die Nitrozellulosemembran auftropfen
Membran ca. 10 Min. trocknen lassen
Färbelösung in die Bakterienschale geben bis die Membran ganz bedeckt ist
Nach 2 bis 3 Min. Färbelösung zur Wiederverwendung in Falcon Röhrchen zurückgießen
Membran so lange unter dem Wasserhahn abspülen bis kein Farbstoff mehr frei wird
Danach 2x 3 Min. mit Entfärber waschen und Membran zwischen zwei Kopierfolien legen
SDS- Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Lösungen:
Trenngelpuffer (100ml)
18,15 g TrisHCl in 90ml H2Odeion lösen
pH mit HCl auf 8,8 einstellen
Mit H2Odeion auf 100 ml auffüllen
Sammelgelpuffer (100ml)
6g TrisHCl
pH mit HCl auf 6,8 einstellen
Mit H2Odeion auf 100 ml auffüllen
Ammoniumpersulfat (APS; immer frisch ansetzen)
0,05g in 1 ml H2O auflösen
Trenngel (12,5%):
H2O 3,4 ml
Trenngelpuffer 2 ml
Acrylamid (40%) 2,5 ml
TEMED 16 µl
Ammoniumpersulfat (APS) 100 µl
Durch Verwendung von Gelen unterschiedlicher Acrylamidkonzentrationen können Proteine unterschiedlicher Größe aufgetrennt werden:
15 % 15 bis 45 kDa
12,5 % 15 bis 60 kDa
10 % 18 bis 75 kDa
7,5 % 30 bis 120 kDa
5 % 60 bis 212 kDa
Durch entsprechende Änderung der Menge an Wasser bzw. Acrylamid kann dafür die Gelkonsistenz noch variiert werden.
Sammelgel (5%):
H2O 1,1 ml
Sammelgelpuffer 0,5 ml
Acrylamid (40%) 225 µl
TEMED 4 µl
Ammoniumpersulfat (APS) 24 µl
Laufpuffer 5x:
15,15g TrisHCl
72g Glycin
5g SDS
In 800ml H2O auflösen
pH mit HCl auf 8,3 einstellen
Mit H2O auf 1000ml auffüllen
Gelapparatur zusammenbauen
Trenngel gießen und fest werden lassen
Sammelgel gießen, Gelkamm einsetzen und erstarren lassen
Gelapparatur mit 1x Laemmli Laufpuffer auffüllen
Gelkamm herausziehen und Proteinproben in gleichen Volumina auftragen
Strom anschließen und Gel bei 80V ca. 2h laufen lassen bis die Farbbande ca. 1 cm vom unteren Trenngelrand entfernt ist.
Färbung eines Proteingels mit Coomassie Blau
Coomassie-Färbelösung
1g Coomassie Blau R-250
450 ml Methanol
450 ml H2O
100 ml Eisessig
Coomassie Entfärber
100 ml Methanol
100 ml Eisessig
800 ml H2O
Procedere:
Gel in Bakterienschale überführen
Coomasie Färbelösung zugeben bis Gel bedeckt
Schale auf Rotationsschüttler stellen und ca. 1h unter Schütteln inkubieren
Färbelösung abgießen (kann mehrfach verwendet werden)
50 ml Coomassie Entfärbelösung zugeben und ca. 2h schütteln
Für eine komplette Enfärbung kann auch über Nacht inkubiert werden
Durch Zugabe eines Papiertaschentuchs kann das Coomassie Blau aus der Entfärbelösung adsorbiert und dadurch ein besseres Ergebnis erzielt werden.
Western Transfer (Tankblot)
Lösungen:
Transfer Puffer (20x)
TrisHCl 38,6g
Glycin 180g
Mit H2Odeion auf 1000ml auffüllen
Transfer Puffer (1x)
50ml Stocklösung
mit H2Odeion auf 1000ml auffüllen
Im Kühlschrank auf 4°C abkühlen
Procedere:
Handschuhe tragen!
Nitrocellulose zuschneiden und für 20 Min. in Transferpuffer präinkubieren
Tansferkammer mit destilliertem Wasser reinigen
Elektrodeneinsatz einsetzen und kleinen Magnetrührfisch in die Kammer geben
Kammer bis zur Hälfte mit Transferpuffer (ca. 400ml)
Kühleinheit einsetzen
Gelsandwich zusammenbauen:
Alle Bestandteile vorher mit Transferpuffer anfeuchten
Luftblasen mit einem Falconröhrchen herausstreichen
Anordnung der Schichten im Sandwich
Oben:
Andere Platte
Nasses Faserpad
Whatman Papier
Nitrozellulose
Gel
Whatman Papier
Nasses Faserpad
Graue Platte
Unten:
Gelkassette schließen und in den Elektrodeneinsatz einsetzen
Transfertank mit Puffer füllen und auf einen Magnetrührer stellen
Elektroden befestigen
Transfer für 1h bei 100V
Western Blot Immunodetektion
Lösungen:
Tris Buffered Saline (TBS; 20x)
100 mmol/l TrisHCl 15,76 g
1,5 mol/l NaCl 87.66 g
Mit H2Odeion auf 800ml auffüllen
pH mit HCl auf 7,5 einstellen
Mit H2Odeion auf 1000ml auffüllen
TBS working solution
Stammlösung 1:10 mit H2Odeion verdünnen
TBS/BSA
3g Bovines Serumalbumin Fraktion V
In 100 ml TBS lösen
Procedere: Handschuhe!!!
Transferapparat ausschalten, Transferkassette entnehmen und öffnen
Faserpad und Filterpapier vorsichtig abziehen
Nitrozellulosemembran vorsichtig abziehen und in eine Bakterienschale oder einen Folienbeutel legen
Zugabe von 10ml TBS/BSA zum Abblocken unspezifischer Bindungsstellen der Membran
30 bis 60 Min Schüttelinkubation bei Raumtemperatur
Danach kann die Membran in der TBS/BSA Lösung unter Zugabe von 1mmol/l Natriumazid im Kühlschrank einige Tage aufbewahrt werden
TBS/BSA abgießen und 3x 10 Min. mit TBS waschen
Membran in einen Folienbeutel übertragen und bis auf eine Seite zuschweißen
Zugabe des Erstantikörpers in entsprechender Verdünnung in 5ml TBS/BSA0,5% und Beutel dann komplett verschließen.
Inkubation für 30 Min. bei 37°C oder für 1 bis 8 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Taumelschüttler
Beutel öffnen und Erstantikörperlösung abgießen (kann einmal wiederverwendet werden)
3x 10 Min. mit TBS spülen
Inkbutation mit dem Zweitantikörper entsprechender Verdünnung in 5 ml TBS im Folienbeutel
Inkubation für 30 Min. bei 37°C oder für 1 bis 8 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Taumelschüttler
3x 10 Min. mit TBS spülen
Danach in Dunkelkammer wechseln
Entwickler und Fixierer vorbereiten
Membran auf Kopierfolie legen und Chemilumineszenz Detektionslösung aufgeben
Nach 5 Minuten Chemilumineszenzlösung abgießen, zweite Kopierfolie auflegen und Luftblasen herausstreichen
Tageslicht ausschalten und Rotlicht einschalten
Membran zwischen den Kopierfolien in die Expositionskassette legen
Film auflegen und sobald eine ausreichende Schwärzung der Banden einsetzt (dauert i.d.R. zwischen 1 und 5 Minuten) in Entwickler überführen
Film ausreichend lange fixieren, dann wässern und trocknen