RNA-Isolierung mit dem Roti Quick Kit

Material:

autoklavierte Pipettenspitzen (60 Min. 121°C)

Eppendorf Gefäße 1ml und 2ml autoklaviert (60' 121°C)

Roti Quick Kit (Firma Karl Roth, Karlsruhe; Kat. Nr. A979.1)

H₂O_deion60 (H2Odeion 60' bei 121°C autoklavieren)

50 ml Ethanol 100%

50 ml Ethanol 70%

Procedere: Mit Handschuhen arbeiten

Zellen oder Gewebestück mit 500µl Roti-Quick 1 lysieren und in 1,5ml Eppendorfgefäß

übertragen

Kann bei -20°C eingefroren werden

Proben im Kühlschrank bei 4°C auftauen

650µl Roti-Quick 2 zugeben, gut mischen und 10 Min. auf Eis inkubieren

15' bei 11000 Rpm bei 4°C in Eppendorfzentrifuge zentrifugieren

vorbereiten: 2ml Eppendorfgefäße beschriften und 500µl Roti Quick 3 vorlegen

Die obere wässrige Phase des Zentrifugats in die vorbereiteten Eppendorfgefäße geben

40 Min. bei -20°C inkubieren

15' bei 13000 Rpm bei 4°C in Eppendorfzentrifuge zentrifugieren

Überstand verwerfen

Pellet in 150µl Roti Quick 1 und 150µl Roti Quick 3 aufnehmen

40 Min. bei -20°C inkubieren

Überstand verwerfen

200µl 70% Ethanol zugeben

5' bei 13000 Rpm bei 4°C in Eppendorfzentrifuge zentrifugieren

Überstand verwerfen

Pellet 10 Min. bei 65°C im Heizblock trocknen

In 25µl H₂O_deion60 lösen

5µl für die Konzentrationsbetimmung entnehmen

Konzentrationsbestimmung mit dem Densitometer => bei 260/280nm

Rest mit H₂O_deion60 auf 100µl auffüllen

30µl NaAcetat (3mol/l, pH5) zugeben

300µl 100% Ethanol zugeben

2h bei -80°C inkubieren

15' bei 13000 Rpm bei 4°C in Eppendorfzentrifuge zentrifugieren

Überstand verwerfen

200µl 70% Ethanol zugeben

5' bei 13000 Rpm bei 4°C in Eppendorfzentrifuge zentrifugieren

Überstand verwerfen

Pellet 10 Min. bei 65°C im Heizblock trocknen

mit H₂O_deion60 auf 1µg/µl einstellen

Reverse Transkription

Material:

PCR-Gefäße autoklaviert (60 Min. 121°C)

autoklavierte Pipettenspitzen (60 Min. 121°C)

H₂O_deion60 (H2Odeion 60' bei 121°C autoklavieren)

RNAse Inhibitor (MBI-Fermentas)

Reverse Transkriptase (MBI-Fermentas)

d-NTP-Mix (10mmol/l, MBI-Fermentas)

Random Hexanucleotid Primers oder Oligo dT Primers (MBI-Fermentas)

PCR-Puffer 5x (MBI-Fermentas)

Procedere: Mit Handschuhen arbeiten

Herstellen des RT-Master Mix (X+1xx):

PCR-Puffer 5x 4µl (x X+1)

H₂O_deion60 2µl (x X+1)

d-NTP-Mix (10mmol/l) 2µl (x X+1)

RNAse Inhibitor 1µl (x X+1)

Mu-MLV Reverse Transkriptase 1µl (x X+1)

In die entsprechende Anzahl (X) PCR Gefäße 5µl Random oder Oligo dT Primers vorlegen

von den im Kühlschrank aufgetauten RNA Proben 5µl (1µg/µl) zugeben

Im PCR Block 5 Min. auf 70°C erhitzen

anschließend sofort auf Eis stellen und 10µl des RT-Master Mix zugeben

Gut mischen und 1h bei 37°C im PCR Block inkubieren

5 min bei 70°C denaturieren

anschließend sofort auf Eis und bei -20°C einfrieren

Polymerase Kettenreaktion

Materialien:

PCR Gefäße (AGS)

PCR-Cycler (Eppendorf)

PCR-Puffer 10x (MBI-Fermentas)

d-NTP Mix 10mmol/l (MBI-Fermentas)

MgCl2 (MBI-Fermentas)

H₂O_deion60 (H2Odeion 60' bei 121°C autoklavieren)

upper Primer

lower Primer

Taq-Polymerase (MBI-Fermentas)

Agarose

TAE-Puffer

DNA 100bp Leiter

Procedere:

PCR Master Mix zusammenpipettieren:

PCR-Puffer 10x 5µl (x X+1)

d-NTP Mix 5µl (x X+1)

MgCl2 4µl (x X+1)

H2Odeion60 10,5µl (x X+1)

UpperPrimer 10µl (x X+1)

LowerPrimer 10µl (x X+1)

Taq-Polymerase 0,5µl (x X+1)

In PCR-Gefäße jeweils 5µl der cDNA aus dem RT-Schritt vorlegen

Dazu jeweils 45µl des PCR-Master Mix zugeben und gut mischen

PCR-Cycler:

Denaturierung: 94°C / 30sek

Annealing: 58 bis 61°C /45sek (Temperatur Primerabhängig)

Extension: 72°C / 45sek

Die Zyklenzahl kann zwischen 25 und 40 Zyklen variieren

Nach dem Amplifizieren können die Proben entweder eingefroren werden oder sofort auf einem 2% Agarosegel in TAE elektrophoretisch analysiert werden

Agarose Gelelektrophorese

2g Agarose mit 1xTAE-Puffer auf 100ml auffüllen

Kurz in der Mikrowelle aufkochen bis die Agarose ganz geschmolzen ist

Auf 60°C abkühlen lassen und dann in die vorbereitete Gelkammer (Gelkamm einsetzen) gießen

Wenn das Gel nach dem Erkalten fest ist den Geltrog in die Kammer einsetzen

10µl jeder PCR-Probe mit 2µl Loading-Puffer mischen und auf das Gel auftragen

5µl der 100bp Leiter als Marker auftragen

Gel an die Spannungsquelle anschließen und ca. 1h bei 120V laufen lassen (DNA-Proben laufen von Minus nach Plus)

Gel 15 Min. in Ethidiumbromid färben

Anschließend 10 Min. in H2O anfärben

Gel auf dem UV-Transilluminator photographieren