Protokoll NTera2 Zellen:

Erhaltungskultur:

Medium

DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin

Konfluente Zellen 2x kurz mit Aqua Braun spülen

Zugabe von 1ml Trypsin/EDTA

Kurz im Brutschrank bei 37°C einwirken lassen (ca. 1 min)

Zellen abklopfen

In 6 ml Medium resuspendieren und in 15ml Falcon Röhrchen geben

2 min bei 1000 Rpm zentrifugieren, Überstand abgießen

Pellet in 6 ml Medium resuspendieren

1ml der Suspension (entspricht ca. 1 Mill. Zellen) in 12 ml Medium verdünnen und auf 75 cm² Zellkulturflasche aussähen

Erneut bis zur Konfluenz wachsen lassen, dabei ca. 2 bis 3mal pro Woche das Medium wechseln, usf.

Zellen einfrieren:

Kryomedium: 1ml Glycerol + 9ml DMEM

Konfluente Zellen wie oben beschrieben trypsinieren und aufteilen.

Reste der Zellen erneut abzentrifugieren und in 4 ml Kryomedium resuspendieren

Aliquots a 1ml in Kryoröhrchen überführen

In Pappbox im Gefrierschrank bei -80°C einfrieren

Neuronale Differenzierung:

Herstellung von Multizellsphäroiden:

500µl der Zellsuspension vom Splitting der konfluenten Erhaltungskultur (s.o.) auf 12 ml Medium geben (sollte etwa einer Zelldichte von 500 000 Zellen/ml entsprechen) und in einer Bakterienschale aussähen

3 Tage inkubieren bis sich genügend Zellhäufchen auf dem Boden gebildet haben

Dann am 3. Tag nach Start der Differenzierung, Medium wechseln und 12 µl einer 1 mmol/l Retinsäure-Sammlösung in Ethanol zum Medium geben

Erneut 3 Tage inkubieren, bis sich genügend freischwimmende Multizellsphäroide (werden auch Embryoid Bodies genannt) gebildet haben.

Ausplattieren der Sphäroide:

Am 6. Tag nach Start der Differenzierung, wird das Retinsäure-haltige Medium gegen Retinsäure-freies Medium ausgetauscht

Die Sphäroide werden dann suspendiert und jeh 4 ml dieser Suspension in zwei 90 mm Zellkulturschalen gegeben (Für Protein bzw. RNA Isolierung)

Nach 2 min werden die Schalen dann mit 8 ml Medium aufgefüllt

Die restlichen 4 ml der Sphäroidsuspension werden mit Medium auf 12 ml aufgefüllt und dann auf eine 24-well-Platte mit Deckgläsern ausgesäht.

Nach 3, 6 und 9 Tagen das Medium der Multiwellplatte und der Zellkulturschalen wechseln. Nach weiteren 3 Tagen sind die Zellen zu Neuronen und Gliazellen differenziert und können für Versuche verwendet werden.